Рекомбинантные ДНК вводятся в клетки – реципиенты. В генной инженерии такие реципиентные клетки играют 2 роли. 1. Они позволяют отыскивать в банке генов клоны синтезируемой рекомбинантной ДНК. 2 Впоследствии такие реципиентные клетки могут использоваться для получения целевых продуктов.

Способ введения рекомбинантной ДНК учитывается на основе вектора какого типа была получена такая рекомбинантная ДНК и в клетки каких организмов необходимо ее ввести путем трансформации клетки или протопласта, или с использованием метода электропорации. Если рекомбинантную ДНК получать на основании фагов, ее можно вводить в изолированную ДНК – это трансвекция. Можно вводить интактные фаговые частицы – это инфекция (космиды, фазмиды).

Др. способы генетического обмена – конъюгация, трансдукция.

В клетках растений – трансформация растительных протопластов, обработка растительных клеток или тканей рекомбинантыми ДНК; широко используются инъекции рекомбинантных ДНК в ядро; использование липосом. Липосомы – сферические структуры, которые имеют липидную оболочку, внутри которой находится рекомбинантная ДНК. Для введения в клетки животных – вирусные инфекции, метод электропорации, микроинъекции в ядро. Если после введения рекомбинантной ДНК все клетки в организме ее наследуют, то говорят о получении трансгенного организма.

Электропорация – клетки или протопласт в течение короткого промежутка времени подвергаются воздействию тока высокого напряжения (2000-4000 вольт). В результате в мембране клетки образуются поры ок. 30 нм, которые могут существовать 1-2 минуты и ч/з которые в клетку могут поступать рекомбинантные ДНК. Затем поры закрываются, а ДНК остается в клетке. Это универсальный способ.

Баллистический метод – применятся преимущественно у эукариот. Используются баллистические пушки в которые вносятся частицы АК или W, на которые напыляются рекомбинантная ДНК. Затем, с помощью инертных газов при Р, такие частицы выстреливаются из пушки в культуру клеток. По различным закономерностям часть частиц попадает в ядро и рекомбинантные ДНК там задерживаются.

Поиск клонов с рекомбинантной ДНК.

Этот этап сложен и непредсказуем.

Самый простой метод – это поиск клонов по фенотипу после введения рекомбинантной ДНК (например пигментация). Можно воспользоваться комплементационными тестами, но необходимо иметь мутантные клетки, дефективные по синтезу активного продукта.

Методы гибридизационные – необходимо наличие специфических меченых ДНК или РНК зондов. Чаще их метят Р 32 . Зондами м. б. короткие олигонуклеотидные последовательности, которые соответствуют наиболее консервативной части отыскиваемого гена. Эти консервативные последовательности могут включать до 100 нуклеотидов для прокариот и до 1000 для эукариот.

После введения рекомбинантной ДНК, формирующиеся на среде колонии, переносятся на специальный нитроцеллюлозный фильтр. Их подвергают лизису и последующей денатурации ДНК с использованием щелочи. ДНК прочно связывается с фильтром. Фильтр промывается и обрабатывается радиоактивным меченым зондом и определяют тот клон с которым этот зонд связался.

Иммунохимические методы – клоны после введения рекомбинантной ДНК лизируют и обрабатывают антителами к соответствующему продукту. Такие антитела – меченые.

Доцент кафедры химического машиностроения в Virginia Tech Чан Лу (Chang Lu). (Фото: Virginia Tech)

Доцент кафедры химического машиностроения Технологического университета Вирджинии (Virginia Tech ) Чан Лу (Chang Lu) и его исследовательская группа из инженеров-химиков нашли, как «значительно улучшить» доставку в клетку генетического материала - ДНК . Статья с описанием их работы опубликована в главном журнале по микрофлюидике Lab on a Chip , а также в Nature .

Конечная цель доктора Лу заключается в применении разработанного ими метода в области создания генетически модифицированных клеток для иммунотерапии рака , лечения стволовым клетками и регенерации тканей.

Один из наиболее широко используемых физических методов доставки генов в клетку является «невероятно неэффективным, потому что проницаемой является только небольшая часть от общей поверхности мембраны», считает доктор Лу.

Метод, к которому обратился Лу, называется электропорацией , по названию известного в течение десятилетий феномена увеличения проницаемости клеток в результате приложения к ним электрического поля, приводящего к образованию крошечных пор в их мембране.

Доктор Лу объясняет механизм действия усовершенствованного им и его коллегами метода электропорации таким образом: «Обычные методы электропорации доставляют ДНК только через очень ограниченную часть поверхности клетки, определяемую физическими явлениями, управляющими взаимодействиями между электрическим полем и клеткой. Наш метод позволяет достичь равномерной доставки ДНК через всю поверхность клетки, что, насколько нам известно, продемонстрировано впервые. Результатом является огромное увеличение объема передачи генетического материала».

В новом подходе используются «гидродинамические эффекты, которые возникают только тогда, когда потоки жидкости перемещаются по изогнутым каналам. Известно, что при таких условиях поток образует вихри. Переносимые таким потоком клетки вращаются, и воздействию электрического поля подвергается бо льшая часть площади их поверхности». Доставка генов с помощью потоков в изогнутых каналах имеет значительные преимущества по сравнению с традиционно используемой электропорацией в статичных растворах и прямых каналах.

«Спиральный канал дает двукратное увеличение по сравнению с прямым и еще большее по сравнению со статичным раствором», - поясняет ученый.

С помощью флуоресцентной микроскопии ученые смогли «картировать» подвергшиеся электропорации области на поверхности клетки и определить степень поступления в нее ДНК.

Фото с сайта Lab on a Chip

Обычная доставка ДНК с использованием кюветного типа устройств со статичной клеточной суспензией идет только в узкой полосе поверхности клетки. Если же электропорация проводится на клетках, плывущих в спиральном или изогнутой канале, изображения значительно отличаются, демонстрируя равномерное распределение переноса ДНК по всей поверхности клетки.

Способы прямого введения генов в клетку

Прямое введение гена в клетку осуществляют несколькими способами:

Трансфекция

Микроинъекция

Электропорация

Метод «мини-клеток»

Упаковка в липосомы

Электронная пушка

При трансфекции ДНК адсорбируется на кристаллах фосфата кальция (Грэхем Ван дер Эб, 1973). Образуются частицы кальциевого преципитата. Они поглощаются клеткой путем фагоцитоза.

Для повышения эффективности трансформации к специфической ДНК, содержащей ген, по которому будет производится селекция, добавляется неспецифическая ДНК-носитель. Обычно для этой цели берут ДНК из тимуса теленка или спермы лосося. Часть ДНК связывается с мембраной и не попадает в клетки. ДНК акцептируют от 15 до 90% клеток. Через несколько суток после введения небольшая доля клеток способны экспрессировать чужеродные гены, но затем уровень экспрессии падает и более или менее стабильную трансформацию претерпевает 10 -3 - 10 -5 клеток.

Для трансфекции используется и ДЭАЭ-декстран, полимер, адсорбирующий ДНК. Эффект вхождения в клетки и время экспрессии высоки, но частота стабильной трансформации ниже, чем при использовании преципитата кальция. Частоту трансфекции увеличивает глицериновый шок (4 минуты в 15% растворе глицерина в НEPES-буфере).

В клетки можно вводить любой ген, если заранее лигировать его с клонированным селективным маркером. Однако дальнейшие исследования показали, что лигирование вне клетки не обязательно. Клетки, поглощающие селективный ген, вместе с ним поглощают и другую ДНК, имеющуюся в кальциевом преципитате. Таким образом, пользуясь методом котрансформации , практически любой клонированный сегмент ДНК можно ввести в культивируемые клетки эукариот, если включить эту ДНК вместе с селективным маркером в состав смеси для образования кальциевого преципитата.

Для трансфекции можно использовать хромосомы или фрагменты хромосом. Клетки-доноры блокируются на стадии митоза. Митотические хромосомы высвобождаются под воздействием осмотического шока и гомогенизации. Их очищают путем дифференциального центрифугирования. Хромосомы осаждают на поверхности клеток хлористым кальцием, а через несколько часов обрабатывают реагентом, способным перфорировать мембраны (например, глицерином).

Для обработки клеток-рецепиентов используются грубо очищенные препараты хромосом, так как хромосомы при этом разрушаются меньше всего. Количество хромосом для обработки 1 клетки ограничено. Лучше использовать не более 20 хромосом на 1 клетку-рецепиент, так как при высоких концентрациях хромосом в суспензии они агглютинируют. Рецепиентная клетка содержит фрагменты донорных хромосом, которые могут встраиваться в геном, могут реплицироваться самостоятельно. Во введенных фрагментах часто наблюдаются делеции.

Не все клетки способны к трансформации геномной ДНК с высокой частотой. Человеческие фибробласты эффективно включают плазмидную ДНК и почти не включают геномную.

Микроинъекция ДНК в клетки млекопитающих стала возможной с появлением прибора для изготовления микропипеток диаметром 0.1-0.5 микрона и микроманипулятора (рис. 45). Так, плазмиды, содержащие фрагмент вируса герпеса с геном тимидинкиназы (ТК) и плазмиду рВR322, были инъецированы в ТК - -клетки и было показано, что ТК - ген проник в ядра и нормально в них реплицировался. Метод введения ДНК с помощью микроинъекций был разработан в начале 70-х годов Андерсоном и Диакумакосом. В принципе, при наличии хорошего оборудования можно за 1 час инъецировать 500-1000 клеток, причем в лучших экспериментах в 50% клеток наблюдается стабильная интеграция и экспрессия инъецированных генов. Преимущество описываемого метода заключается также в том, что он позволяет вводить любую ДНК в любые клетки, и для сохранения в клетках введенного гена не требуется никакого селективного давления.

Рис. 45. Введение ДНК путем микроинъекции

Электропорация основана на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. В среду для электропорации добавляют клетки и фрагменты ДНК, которые необходимо ввести в клетки (рис. 46). Через среду пропускают высоковольтные импульсы (напряжение 200 - 350 В, длительность импульса 54 мс), приводящие к образованию пор (электропробой) в цитоплазматической мембране, время существования и размер которых достаточны, чтобы такие макромолекулы, как ДНК, могли из внешней среды войти в клетку в результате действия осмотических сил. При этом объем клетки увеличивается.

Напряженность электрического поля и продолжительность его действия, концентрации трансформирующей ДНК и реципиентных клеток для каждой системы клеток подбирают экспериментально, с тем чтобы достичь высокого процента поглощения ДНК выжившими клетками. Показано, что в оптимальных условиях электропорации количество трансформантов может достигать 80% выживших клеток.

Электропорация - физический, а не биохимический метод, и это, по-видимому, обусловливает его широкое применение. Многочисленные исследования продемонстрировали, что электропорация может успешно использоваться для введения молекул ДНК в разные типы клеток, такие как культивируемые клетки животных, простейшие, дрожжи, бактерии и протопласты растений. Электропорирующий эффект высоковольтного разряда на бислойную липидную мембрану, по-видимому, зависит от радиуса ее кривизны. Поэтому мелкие бактериальные клетки эффективно поглощают ДНК при значительно большей напряженности (10 кВ/см и более), чем крупные животные и растительные клетки, эффективно поглощающие ДНК при напряженности поля 1-2 кВ/см.

Электропорация - наиболее простой, эффективный и воспроизводимый метод введения молекул ДНК в клетки. Однако до недавнего времени этот метод использовался в ограниченном числе лабораторий в связи с отсутствием серийных приборов - электропораторов. Появление и совершенствование таких приборов в ближайшие годы приведет к широкому применению данного подхода в генетической инженерии самых разных типов клеток.

Рис. 46. Метод электропорации

«Мини-клетки» получают путем блокирования донорных клеток митозе колцемидом. При продолжительной обработке клеток колцемидом в них вокруг каждой хромосомы формируется новая ядерная мембрана. Обработка цитохалазином В и центрифугирование приводит к образованию мини-клеток, представляющих микроядра, инкапсулированные в цитоплазматическую мембрану.

Полученные мини-клетки очень чувствительны к разного рода воздействиям, поэтому для слияния подбирают специальные мягкие условия. Метод трудный, капризный, эффективность низкая – 10 -6 – 10 -7 .

Упаковка в липосомы используется для защиты экзогенного генетического материала от разрушающего действия рестриктаз.

Липосомы - сферические оболочки, состоящие из фосфолипидов. Получают их путем резкого встряхивания смеси водного раствора и липидов, либо обрабатывая ультразвуком водные эмульсии фосфолипидов. Липосомы, состоящие из фосфатидилсерина и холестерина наиболее пригодны для введения ДНК в клетки животных и растений. Системы переноса с помощью липосом низкотоксичны по отношению к клеткам.

Метод биологической баллистики (биолистики) является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации растений, особенно однодольных.

Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частички вольфрама, диаметром 0,6-1,2 мкм, напыляется ДНК вектора, содержащего необходимую для трансформирования генную конструкцию. Вольфрамовые частички, несущие ДНК, наносятся на целлофановую подложку и помещаются внутрь биолистической пушки. Каллус или суспензия клеток наносится в чашку Петри с агаризированной средой и помещается под биолистическую пушку на расстоянии 10-15 см. В пушке вакуумным насосом уменьшается давление до 0,1 атм. В момент сбрасывания давления вольфрамовые частички с огромной скоростью выбрасываются из биолистической пушки и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток.

Обычно клетки, располагающиеся непосредственно по центру, погибают из-за огромного количества и давления вольфрамовых частиц, в то время как в зоне 0,6-1 см от центра находятся наиболее удачно протрансформированные клетки. Далее клетки осторожно переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации.

С помощью биолистической пушки были протрансформированы однодольные растения, такие, как кукуруза, рис, пшеница, ячмень. При этом были получены стабильные растения-трансформанты. Кроме успехов в получении трансгенных однодольных, биолистическая трансформация применяется для прямого переноса ДНК в эмбриогенную пыльцу и дальнейшего быстрого получения трансгенных дигаплоидных растений, которые являются важным этапом в селекционной работе. В настоящее время этим методом была проведена трансформация растений табака и после регенерации гаплоидных растений получены стабильные трансформанты.

Одним из наиболее перспективных вариантов систем доставки генов в клетки являются полиплексы – комплексы переносимой ДНК и катионных полимеров различной природы. В данной статье описываются свойства полиплексов на основе нескольких типов катионных полимеров, их транспорт в ядра клеток-мишеней, а также один из подходов для лечения злокачественных новообразований с помощью этих конструкций.

Введение

Генная терапия – лечение наследственных, онкологических и других заболеваний путём внесения в клетки пациента необходимого генетического материала с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций [Горбунова и др., 1997]. Для доставки ДНК или РНК в клетки-мишени создаются носители (векторы) для обеспечения высокого уровня трансфекции, т.е. переноса экзогенной (чужеродной) ДНК или РНК в определённые типы клеток. Помимо этого, векторы должны обеспечивать защиту генетической информации, т.к. в условиях in vivo чужеродная ДНК нестабильна из-за быстрой деградации сывороточными нуклеазами , ферментами, расщепляющими нуклеиновые кислоты.

Типы транспортёров генетического материала

В природе существуют специализированные структуры для доставки генетической информации в клетки – вирусы. Поэтому их начали использовать в качестве транспортёров генов. В то же время использование вирусных векторов имеет целый ряд ограничений. Во-первых, это малая ёмкость переносимого генетического материала и свойственная вирусам собственная клеточная специфичность. Во-вторых, это возможность вирусов возвращения к дикому типу в результате рекомбинации при прохождении однотипной инфекции. В-третьих, белки вирусных частиц обладают высокой иммуногенностью, в результате чего повторное их введение вызывает иммунный ответ. Наконец, массовое производство вирусных векторов всё ещё достаточно проблематично и требует больших затрат. В настоящее время активно разрабатываются различные варианты невирусных носителей на основе катионных липидов и катионных полимеров. Эти катионные молекулы способны спонтанно формировать самособирающиеся нанокомплексы с отрицательно заряженной молекулой ДНК за счёт электростатических взаимодействий. Самособирающиеся комплексы, состоящие из катионных липидов и ДНК, называют липоплексами, состоящие из катионных полимеров и ДНК – полиплексами.

Катионные полимеры, используемые для создания полиплексов

Для целей генотерапии и биотехнологии предложено большое количество катионных полимеров или поликатионов. Поликатионы конденсируют ДНК в компактные нанокомплексы, обеспечивая стабильность ДНК и защиту от действия нуклеаз. В качестве ДНК-связывающих полимеров могут служить катионные белки, синтетические гомополимеры аминокислот (полилизины, полиаргинины), полисахарид хитозан, полиэтиленимин, дендримеры различного состава и другие модифицированные полимеры . Степень компактизации ДНК определяется суммарным зарядом комплекса, который, в свою очередь, зависит от отношения количества положительных групп полимеров к числу отрицательных фосфатных групп ДНК. Обычно в составе полиплексов поликатион находится в избытке, в результате чего формируются наноразмерные комплексы (от нескольких десятков до нескольких сотен нм), которые растворимы в воде и положительно заряжены (рис. 1, 2). В противном случае комплексы будут нестабильны.

Рис. 1. Схема образования полиплексов из катионных полимеров и кольцевой молекулой ДНК (плазмидой) . Рис. 2. Изображение полиплексов на подложке, полученное с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (деление шкалы 200 нм), .

Одним из первых применяемых для доставки генов поликатионов был поли-L-лизин (ПЛ, рис. 3), который благодаря своей пептидной природе является биодеградабельным, что делает его крайне удобным для использования in vivo. Часто для устранения нежелательных эффектов, связанных с высокой плотностью поверхностного заряда, применяют сополимер ПЛ с полиэтиленгликолем (ПЭГ), . В результате такой модификации уменьшается поверхностный заряд комплекса, что предотвращает неспецифическую адсорбцию отрицательно заряженных сывороточных белков крови на полиплексах, а также уменьшает цитотоксичность комплексов.

Полиэтиленимин (ПЭИ, рис. 3) считается одним из наиболее перспективных вариантов поликатионов для создания полиплексов на его основе. ПЭИ синтезируют в двух формах: линейной и разветвлённой. ПЭИ обладает большим количеством амино- и иминогрупп, способных к протонированию, в результате чего он проявляет буферные свойства при физиологических условиях. Полиплексы на основе ПЭИ отличаются более эффективной трансфекцией и защитой от действия нуклеаз по сравнению с другими поликатионами, что связано с высокой плотностью зарядов на ПЭИ и более компактным сворачиванием ДНК. Сильный положительный заряд приводит к токсичности ПЭИ, что вместе с отсутствием биологического разложения ПЭИ являются лимитирующими факторами для использования ПЭИ in vivo. С целью снижения цитотоксичности ПЭИ модификацируют с помощью полиэтиленгликоля, обладающего низкой токсичностью и высокой гидрофильностью.

Рис. 3. Катионные полимеры, используемые для создания полиплексов, и .

Другим представителем поликатионов, используемых в доставке генетической информации являются полиамидоамины (ПАМАМ, рис. 3). Эти соединения представляют собой сильноветвящиеся дендримеры. Благодаря ветвлению ПАМАМ обладают большой гибкостью, в лучшей степени компактизуют ДНК, полиплексы на их основе более стабильны, чем все остальные, . По своим свойствам имеет много общего с ПЭИ.

Хитозаны (рис. 3) представляют собой полисахариды, построенные из D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина, связанных (1>4) гликозидными связями. В зависимости от молекулярного веса и степени деацетилирования хитозаны формируют стабильные комплексы различной величины с переносимой ДНК. Маленькие, или наоборот, слишком большие полимеры хитозана ведут к снижению экспрессии переносимого гена. Основным достоинством полиплексов на основе хитозана является биодеградабельность, .

На эффективность доставки полиплексов влияют многие факторы: молекулярный вес, степень разветвленности, полимеризации и тип полимера, размер частиц, ионная сила раствора, поверхностные заряды комплексов, а также условия проведения эксперимента. Оптимальный подход должен учитывать каждый из этих факторов и их влияние на свойства комплекса, поглощение клетками-мишенями комплексов, токсичность.

Существуют несколько подходов для обеспечения специфичности действия полиплексов на клетки-мишени. Один из них включает в себя адресную доставку нанокомплексов в определённые типы клеток. Этот подход связан с присоединением к полиплексам компонентов (лигандов), рецепторы к которым в большом количестве присутствуют на поверхности клеток-мишеней. В качестве специфичных лигандов используются различные белки, сахара, пептиды, антитела и т.д. Другая стратегия заключается в использовании таких транспортируемых генов, которые были бы активны только в определённых клетках, при этом доставка комплексов происходит неспецифично, то есть в любые клетки.

Проникновение полиплексов в клетки-мишени

Процесс доставки генетического материала включает два этапа: внеклеточный (путь от места введения до клеток-мишеней) и внутриклеточный (взаимодействие с клетками-мишенями, эндоцитоз, выход из эндосом, доставка в ядро). Внутриклеточные пути транспорта полиплексов представлены на рисунке 4.

Первым барьером, который необходимо преодолеть полиплексу на пути до клетки-мишени является кровь и внеклеточный матрикс. Именно поэтому необходимо подобрать такие физико-химические параметры комплекса, чтобы увеличить его стабильность, избежать неспецифических взаимодействий и возможности иммунного ответа. Во-первых, в составе полиплекса ДНК должна быть защищена от действия внеклеточных нуклеаз. Во-вторых, отрицательно заряженные белки сыворотки крови (альбумин, фибриноген, иммуноглобулины и др.), а также белки внеклеточного матрикса (коллагены) способны адсорбироваться на поверхности заряженных нанокомплексов, что ведет за собой изменение поверхностного заряда полиплексов, приводит к увеличению размера комплексов и к их агрегации. При введении полиплексов в организм они частично накапливаются в тканях и подвергаются фагоцитозу. По этим причинам часто применяют местное введение полиплексов (например, в опухоль при раке) в расчёте на их неспецифическое взаимодействие с клетками ткани.

Рис. 4. Внутриклеточные пути транспорта полиплексов, .

Полиплексы сначала адсорбируются на плазматической мембране, поглощаются путём эндоцитоза, после чего они должны покинуть эндолизосомы и пересечь ядерную оболочку для попадания в ядро. Существуют также альтернативные пути транспорта, не всегда приводящие к доставке комплексов в ядро. Помимо этого, для экспрессии переносимого гена необходима диссоциация полиплекса на катионный полимер и свободную ДНК.

Следующим этапом доставки генетического материала в клетки-мишени является их взаимодействие с плазматической мембраной и поглощение клеткой. Как было отмечено выше, связывание полиплексов с клетками в отсутствие лиганда происходит неспецифично в результате электростатического взаимодействия с отрицательно заряженной плазматической мембраной. В большинстве случаев такие полиплексы поглощаются путём неспецифического адсорбтивного эндоцитоза . При включении лиганда в состав комплекса можно добиться поглощения с помощью клатрин-зависимого рецептор-опосредованного эндоцитоза . Другие пути захвата зависят от типа клеток и включают в себя фагоцитоз и кавеолин-зависимый эндоцитоз. Одна из стратегий для улучшения доставки полиплексов в клетку включает в себя использование вирусных проникающих пептидов, таких как TAT-пептид, впервые выделенный из вируса ВИЧ-1. Использование этих последовательностей обеспечивает попадание конструкций в клетку, и доставку полиплексов в клеточное ядро.

Одним из самых важных этапов транспортного пути полиплексов является их выход из эндосом. Как известно, эндосомы представляют собой систему трубочек и пузырьков, что необходимо для сортировки поглощённых макромолекул. Сортирующие эндосомы расположены ближе к плазматической мембране . За счёт работы протонных помп в них понижается рН (около 6,5 в сортирующих эндосомах). Дальнейший транспорт может идти либо по пути рециркуляции с выбросом поглощённых молекул во внемембранное пространство, либо по литическому пути, когда происходит дальнейшее закисление среды в поздних эндосомах, и макромолекулы поступают в лизосомы. В лизосомах содержимое закисляется до рН 5, и поглощенные молекулы деградируют под действием гидролитических ферментов, которые активируются при низком рН. Продукты деградации удаляются из клетки путём экзоцитоза или переносятся в цитоплазму, где используются как строительный материал.

Считается, что полиплексы на основе ПЭИ в силу своих свойств способны выходить из эндосом благодаря так называемому эффекту «протонной губки» (proton sponge effect). Эта гипотеза основана на том, что катионные полимеры за счёт наличия непротонированных вторичных и третичных аминов создают буферный эффект, в результате чего H±АТФаза, накачивающая протоны в эндосомы, начинает работать активнее. При этом происходит накопление внутри эндосом анионов хлора. В результате из-за резкого увеличения осмотического давления происходит набухание и лизис, что позволяет полиплексам попасть в цитозоль неповреждёнными. Предложен и другой механизм выхода из эндосом для полиплексов, который заключается в дестабилизации эндосомальной мембраны из-за высокой поверхностной плотности заряда нанокомплексов . Комплексы на основе ПЛ и хитозана не вызывают эффекта «протонной губки» и в меньшей степени способны дестабилизировать мембрану эндосом, что приводит к гораздо меньшей эффективности трансфекции.

Выйдя из лизосом, полиплексы оказываются в перинуклеарном пространстве, после чего комплекс диссоциирует на свободный поликатион и ДНК. Считается, что это происходит за счёт конкуренции за катионные группы между фосфатными группами ДНК и низкомолекулярными соединениями и анионами цитоплазмы. В некоторых случаях диссоциация комплекса происходит, по-видимому, в ядре. Главным барьером на пути плазмидной ДНК в клеточное ядро служит двойная ядерная оболочка. Для доставки в ядро макромолекул в их состав включают последовательность ядерной локализации (ПЯЛ), которая в комплексе с?- и?-импортинами будет узнаваема ядерным поровым комплексом (ЯПК) и активно проникать внутрь ядра. Через ЯПК путём пассивной диффузии могут проходить только маленькие молекулы (<40 кД, ~10 нм). Так как освободившаяся после распаковывания комплекса свободная плазмидная ДНК не имеет последовательности ядерной локализации, то в ядро будет проходить очень незначительная часть плазмид (не более 0,1–0,001%). Кроме того, установлено, что около 50% инъецированной ДНК деградирует в цитозоле уже через 1–2 часа после введения . Но т.к. клетки опухолей, против которых и направлена генная терапия, отличаются активной пролиферацией, то ДНК без труда проникает в ядра дочерних клеток во время митотического цикла, когда ядерная оболочка демонтирована.

Механизмы действия терапевтических генов

После проникновения плазмиды в ядро начинается экспрессия терапевтического гена. Для придания специфичности действия полиплексам терапевтический ген в составе плазмиды ставится под контроль промотора (область гена, на которую садится РНК-полимераза перед транскрипцией), активного только в опухолевых тканях. Примерами могут служить промотор гена антиапоптозного белка сурвивина или гена фермента теломеразы. В качестве терапевтического гена может быть использован ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSVtk), которая обладает способностью фосфорилировать антигерпесные соединения ацикловир и ганцикловир . Эти соединения вводятся в опухоль спустя некоторое время. Далее клеточные киназы (фосфорилирующие ферменты) превращают фосфорилированные ацикловир или ганцикловир в трифосфаты, которые способны включаться во вновь синтезированную ДНК во время удвоения при клеточном делении и терминировать её синтез. В результате клетки, в ядра которых попал ген тимидинкиназы, уничтожаются в присутствии этих веществ. При этом погибают именно делящиеся клетки, а не покоящиеся, которые не синтезируют ДНК и не включают ганцикловир или ацикловир. Такой механизм действия терапевтического гена можно использовать для целей генной терапии раковых опухолей, клетки которых быстро делятся.

Список литературы:

1. Горбунова В.Н., Баранов В.С. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. С.-Пб., «Специальная литература», 1997, с.287.
2. Dunlap D.D., Maggi A., Soria M.R., Monaco L. Nanoscopic structure of DNA condensed for gene delivery. //Nucl. Acids. Res., 1997, vol. 25, 3095–3101.
3. Park T.G., Jeong J.H., Kim S.W. Current status of polymeric gene delivery systems. // Adv. Drug Deliv. Rev., 2006, vol. 58, 467– 486.
4. Pack D. W., Hoffman A. S., Pun S. and Stayton P. S. Design and development of polymers for gene delivery. // Nature Rev., Drug Discovery, 2005, vol. 4, 581.
5. Lechardeur D., Verkman A.S., Lukacs G. L. Intracellular routing of plasmid DNA during non-viral gene transfer. // Adv. Drug Deliv. Rev., 2005, vol. 57, 755– 767.
6. Maxfield F.R. and McGraw T.E. Endocytic Recycling. // Nature Rev. Mol. Cell. Biol., 2004, vol. 5, 121–132.
7. Reid R., Eng-Chung M., Eng-Chang H. and Topal M.D. Insertion and extension of acyclic, dideoxy, and ara nucleotides by herpesviridae, human alpha and human beta polymerases. // J. Biol. Chem., 1988, vol. 263, 3898–3904.

Дурыманов Михаил , студент Биологического факультета МГУ

Статья – призер научно-популярного конкурса на конференции «Ломоносов 2009» (Биологический факультет, секции «Нанобиотехнология», «Биоинженерия», «Биофизика».

8860 0

В настоящее время известно около 40 различных способов доставки рекомбинантной ДНК в клетки, по-разному решающих проблему преодоления плазматической мембраны. Пока не существует единой классификации методов доставки рекомбинантной ДНК в клетки. Каждый автор обзоров классифицирует по-своему, возможно, потому, что для многих эмпирически найденных методов механизм преодоления мембраны не ясен до сих пор, например для трансформации. С терминологией также существует неопределенность, что неудивительно для бурно развивающейся новой области науки и практики.

Каждый из методов доставки чужеродной ДНК в клетки имеет свои особенности, преимущества и недостатки в отношении выживаемости клеток, эффективности введения, универсальности, возможностей технического осуществления. Выбор метода зависит от типа клеток-хозяев и типа использованного вектора, а также от личных предпочтений и возможностей экспериментатора. Ниже подробно рассмотрены некоторые наиболее известные способы доставки ДНК в клетки-мишени.

Трансформация в самом общем значении - это процесс введения свободной ДНК в клетку. В более узком значении термин применяется в основном по отношению к бактериям, обозначая процесс поглощения рекомбинантной ДНК компетентными клетками, индуцированный температурным фазовым переходом клеточной мембраны. E. coli является самым распространенным организмом при работе с рекомбинантными ДНК, и чтобы обеспечить внедрение в клетки плазмидной ДНК, клетки выдерживают с ледяным раствором СаС12 и ДНК, а затем подвергают тепловому шоку при 42 °С в течение ~1 мин.

По-видимому, в результате такой обработки происходит локальное разрушение клеточной стенки. Эффективность трансформации, которая определяется как число трансформантов на 1 мкг добавленной ДНК,
при этом составляет примерно 10000 - 10000000 . Эффективность этого метода невысока, приблизительно менее 0,1 % клеток оказываются трансформированными, но этот недостаток компенсируется применением схем отбора, позволяющих быстро идентифицировать нужные клоны.

Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются компетентными. Доля этих клеток в популяции обычно очень мала, но ее можно повысить, используя специальную питательную среду, условия культивирования и химические индукторы компетентности (подобранные, как правило, эмпирически). Часто используемый этап подготовки компетентных клеток получение сферопластов - клеток, частично или полностью (протопласты) лишенных наружной ригидной клеточной стенки.

Например, только таким способом была осуществлена эффективная трансформация многих грамположительных бактерий родов Bacillus, Listeria, Streptommyces и др. Некоторые методики трансформации дрожжей также включают стадии ферментативного удаления оболочки дрожжевой клетки с помощью глюкозидаз. Для организмов, устойчивых к химическим индукторам компетентности или не обладающих природной компетентностью, применяются другие системы доставки ДНК.

Конъюгация. Существуют бактериальные плазмиды (конъюгативные плазмиды), обладающие способностью создавать межклеточные контакты, через которые они и переходят из одной клетки в другую. Образование контактов между донорной и рецепиентной клетками обеспечивается конъюгативными свойствами плазмид, а сам перенос ДНК - мобилизационными. При этом конъюгативная плазмида может увлекать за собой обычный плазмидный вектор, находящийся в той же клетке.

Таким образом можно трансформировать клетки-реципиенты, с трудом поддающиеся трансформации другими способами. Например, показан мобилизационный перенос челночного вектора pAT187 с широким кругом хозяев из E. coli в различные грамположительные бактерии (родов Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus и др.), хотя и с намного меньшей эффективностью, чем для переноса между разными штаммами E. coli.

Более того, недавно была продемонстрирована возможность конъюгативного переноса ДНК из бактериальных клеток в культивируемые клетки животных. В процессе конъюгации переносится только одна цепь донорской плазмиды, на которой затем синтезируется вторая цепь. Это приводит к тому, что конъюгативно передаваемая плазмида не подвергается атаке хозяйских рестриктаз. Эффективность этого метода для бактерий сопоставима с трансформацией.

Вирусная инфекция. Для внедрения векторов на основе вирусов широко используется природный инфекционный путь заражения клетки-хозяина, который зависит от типа вируса.

Перфорационные методы. Одним из популярных методов введения нуклеиновых кислот в клетки-мишени является электропорация - временное создание пор в бислойной липидной мембране под кратким воздействием электрического поля. Является универсальным физическим методом трансформации, методика которого разработана практически для всех типов клеток.

При работе с E. coli подготовленную клеточную суспензию (~50 мкл) и ДНК помещают между электродами и подают единичный импульс тока длительностью ~4,5 мс при напряжении 1,8 кВ, расстояние между электродами составляет 1 мм. После такой обработки эффективность трансформации повышается до 109-1011 для малых плазмид (~3-6 тпн) и до 106 для больших (~135 тпн). Аналогичные условия используют для введения в Е. coli вектора ВАС.

Электропорирующий эффект высоковольтного разряда на бислойную липидную мембрану, по-видимому, зависит от радиуса ее кривизны. Поэтому мелкие бактериальные клетки эффективно поглощают ДНК при значительно большей напряженности (12-18 кВ/см), чем крупные животные и растительные клетки, эффективно поглощающие ДНК при напряженности поля 1-2 кВ/см. Электропорация - наиболее простой, эффективный и воспроизводимый метод введения молекул ДНК в клетки, требующий, однако, специального прибора электропоратора.

Другие перфорационные методы доставки ДНК в клетку: обработка клеток ультразвуком, соскабливание клеток с субстрата в присутствии экзогенного материала, центрифугирование клеток в среде с ДНК в сочетании с электропорацией, осмотическая перфорация плазматической мембраны, пробой клетки лазерным микролучом, использование порообразующего токсина стрептолизина-О.

Трансфекция. Первоначально этот термин обозначал введение в клетки вирусной ДНК, сейчас его значение расширилось до обозначения введения любой чужеродной ДНК в клетки эукариот. Термин «трансформация», обозначающий процесс введения ДНК в клетку для прокариот и дрожжей, оказалось, использовать неудобно, поскольку применительно к животным клеткам трансформация - это превращение нормальных клеток в раковые. В узком смысле под трансфекцией в основном понимают введение ДНК в эукариотические клетки с помощью различных химических реагентов.

Одним из первых разработанных методов эффективной трансфекции была инкубация ДНК с ДЕАЕ-декстраном. Полученная эффективность была сопоставима с трансформацией бактерий и достигала 106 трансфектантов на мкг ДНК.

Механизм действия ДЕАЕ-декстрана окончательно не установлен, но известно, что он связывается с ДНК и с клеточной мембраной, стимулируя пиноцитоз (рис. 2.8), хотя сам клетками не захватывается. К недостаткам метода стоит отнести токсичность ДЕАЕ-декстрана для некоторых типов клеток, зависимость эффективности от качества препарата, очень малую частоту получения стабильных трансфектантов.

Рис. 2.8. Схема введения ДНК в составе различных комплексов в клетку путем эндоцитоза: фагоцитоза и пиноцитоза (а). Схематичное изображение частицы из нелипидного поликатиона в дендроформе со связавшейся ДНК, отрицательный заряд которой компенсируется катионным полимером (б)

Эффективность трансфекции удалось повысить в 10-100 раз инкубацией клеток с осажденной фосфатом кальция ДНК. Плотные частицы кальциевого преципитата ДНК поглощаются клеткой путем фагоцитоза (рис. 2.8), но при этом только небольшая часть проникших молекул достигает ядра и встраивается в хромосомную ДНК. Кальций-фосфатный метод более эффективен и дешев, но вызывает разрыв молекул ДНК, что переводит кольцевые молекулы в линейную форму, иногда неинфекционную в случае трансфекции вирусов. Кроме того, условия кальций-фосфатной трансфекции приходится подбирать для каждых клеток-мишеней индивидуально.

В ходе поисков других трансфецирующих реагентов было выявлено, что полимерные молекулы, несущие избыточный катионный заряд, могут существенно повысить эффективность трансфекции. Полимерные катионы образуют с нуклеиновыми кислотами устойчивые комплексы с нейтрализованными зарядами, которые могут с высокой эффективностью транспортировать ДНК и РНК внутрь клетки, защищая от действия эндонуклеаз на пути к ядру (рис. 2.9).

Рис. 2. 9. Схема транспорта ДНК в ядро клетки в составе комплекса поликатион-ДНК, связанного со специфическим лигандом, путем лиганд-опосредованного эндоцитоза

Синтетические нелипидные полимерные катионы в линейной или разветвленной конформации (дендритная форма) могут конденсировать ДНК и РНК в относительно малые частицы, которые затем связываются с клеточной мембраной и проникают в клетку путем неспецифического эндоцитоза. В настоящее время для трансфекции из группы нелипидных поликатионов используются в основном полиэтиленимин, полиамидоамины и дендримеры на их основе, катионные белки типа полилизина, протамина и гистонов, а также различные коммерческие продукты, например PAMAM.

Революцией явилось введение в практику первого низкотоксичного катионного липида ДОТМА (1,2-диолеил-3-N,N,N-триметиламинопропан), синтезированного Фелгнером (Feigner, 1987) с соавторами. Эффективность трансфекции с использованием катионного липида (рис. 2.10) была приблизительно в 100 раз больше относительно любого другого химического реагента, причем с большой долей стабильных трансгенных клеток.

Рис. 2. 10. Структура комплекса с ДНК (а) и общая структура катионного ли-пидного полимера (б). Катионные липидные полимеры (линейные и разветвленные), похожие по своей структуре и свойствам на клеточные мембранные фосфолипиды формируют комплексы с ДНК в виде многослойных катионных липосом (а) при простом смешивании реагентов. Такие комплексы проникают в клетку путем эндоцитоза или слияния с клеточной мембраной через липидную часть

Одновременно был введен в практику новый термин «липофекция», подчеркивающий высокую эффективность генетической трансформации клеток, приближающую липид-катионные комплексы к инфекционным вирусным частицам.

Развивая успех, были разработаны многочисленные вариации этих соединений (липофектин, липофектамин, селлфектин и др.).

Параллельно разрабатывались средства доставки на основе фосфолипидных липосом, начиненных ДНК или РНК.

Маленькие сферы из искусственных мембран могут сливаться с плазматическими мембранами клеток или поглощаться эндоцитозом, высвобождая содержимое внутрь клетки. Небольшую эффективность липосомной трансфекции повысило введение в структуру липосом фосфолипидов, например, кардиолипина и фосфатидилэтаноламина, образующих наряду с бислойными мембранами также инвертированные мицеллярные структуры, известные как кубические и гексагональные фазы, способные инициировать слияние мембран.

Липосомный метод достаточно капризен и требует тщательного подбора всех условий для эффективной трансфекции конкретных клеток. Кроме того, процедура инкапсулирования, обычно обработка ультразвуком, часто повреждает крупные молекулы ДНК.

Новым этапом в развитии трансфекционных реагентов стала разработка более эффективной и адресной доставки в специфические клетки-мишени нуклеиновых кислот путем введения в структуру синтетических трансфекционных реагентов и липосом различных лигандов для связывания с мембранными белками-рецепторами. Наличие таких адресных групп (лигандов), узнаваемых клеточными рецепторами, позволяет использовать механизмы лиганд-опосредованного эндоцитоза (см. рис. 2.9).

В качестве таких лигандов используют белки и пептиды, узнаваемые рецепторами; олигосахариды, поскольку на поверхности многих животных клеток присутствуют лектины -белки-рецепторы, специфически их связывающие; полисахариды. Процессы взаимодействия с клетками таких адресных комплексов ДНК(РНК)-трансфекционный реагент имеют сходство с проникновением в клетку вирусных частиц.

В настоящее время биотехнологические фирмы предлагают широкий спектр разнообразных трансфекционных реагентов - от самых простых и дешевых до самых последних разработок, специализированных под разные типы клеток и задачи. Также интенсивно продолжается создание новых еще более эффективных трансфецирующих реагентов.

Микроинъекция - клеточная мембрана прокалывается микроиглой и раствор, содержащий ДНК, вводится в цитоплазму клетки или напрямую в ядро, если ядро достаточно большое (например, ядро яйцеклетки). Микроинъекция ДНК в клетки млекопитающих стала возможной с появлением прибора для изготовления микропипеток диаметром 0,1-0,5 мк и микроманипулятора. Метод очень эффективен, доля клеток со стабильной интеграцией и экспрессией инъецированных генов может достигать 50 %. Преимущество описываемого метода заключается также в том, что он позволяет вводить любую ДНК в любые клетки и для сохранения в клетках введенного гена не требуется никакого селективного давления.

Баллистическая трансфекция, биобаллистика, или биолистика (бомбардировка микрочастицами), основана на обстреле клеток микросферами размером около 1 -2 мкм, покрытых ДНК. Применяются микрочастицы золота, вольфрама (иногда бывает фитотоксичен), силикона и различные синтетические наносферы. Микрочастицы, покрытые ДНК, проходят через клеточные слои и переносят генетическую конструкцию непосредственно в органеллы и ядра клеток. Созданный для этой цели «генный пистолет» (gene gun), или «генная пушка», который был разработан Д. Сенфордом (J. Sanford) в 1987 г. для введения ДНК в зерна хлебных злаков, по своему устройству сходен с пневматическим оружием (рис. 2.11).

Рис. 2.11. Введение рекомбинантной ДНК в листья растения с помощью многоразового «генного пистолета» фирмы Bio-Rad (а) и его общая схема (б). Гелиевый импульс выбрасывает микрочастицы, покрытые ДНК или РНК, из капсулы с образцом. Микрочастицы, несущие ДНК, ускоряются и фокусируются для максимального проникновения в клетки, продвигаясь по разгоночному каналу и по стволу пистолета, при этом на широком выходе поток гелия диффузно расходится в стороны. Фильтр-спейсер поддерживает оптимальную дистанцию для поражения цели с максимальным удалением гелия, чтобы свести к минимуму повреждающие воздействия на поверхность клеток

Глубина проникновения микрочастиц, как правило, невелика - до 1 мм, однако при особых условиях обстрела микрочастицы могут проникать в ткань на глубину до 4-5 мм и переносить гены, например, в волокна поперечно-полосатых мышц. Баллистическая трансфекция очень эффективна даже там, где толстые клеточные стенки (дрожжи, растения) являются препятствием для многих других методов доставки, и применяется в том числе для тканей, органов и даже целых организмов. В настоящее время широко используется в генотерапии, для получения трансгенных животных и растений.

Такое разнообразие средств и методов трансфекции обусловлено различными задачам, широким спектром используемых клеток-мишеней и типов доставляемых в клетки нуклеиновых кислот, а также потребностями общества в получении все более эффективных средств доставки генетической информации в клетки, ткани и целые организмы. Особое внимание уделяется развитию трансфекционных реагентов и методов в связи с поразительными перспективами генной терапии человека, для которой необходимы адресные высокоэффективные и безопасные средства генной доставки.

Стабильное и транзиентное внедрение чужеродной ДНК в клетку. После введения рекомбинантной ДНК в эукариотическую клетку, лишь ее малая часть оказывается в ядре, поскольку ядерная мембрана является труднопреодолимым барьером для чужеродной ДНК. В ядре рекомбинантная ДНК может быть интегрирована в хромосому или некоторое время существовать во внехромосомном состоянии.

Соответственно, различают стабильную трансфекцию, когда рекомбинантные ДНК интегрируются в хромосомы клеток-реципиентов и становятся их неотъемлемой частью, а также временную, или транзиентную, трансфекцию (transient transfection), при которой молекулы рекомбинантной ДНК существуют и транскрибируются в ядрах во внехромосомном состоянии непродолжительное время. Стабильное наследование внедренной чужеродной ДНК - основное условие получения трансгенных организмов для хозяйственных целей.

Поэтому разработке методов введения ДНК в клетки, ведущих к получению большей доли стабильных трансформантов, уделяется особое внимание. Кроме того, большой процент стабильных трансформантов, также позволяет отказаться от селективных и маркерных генов, являющихся балластными при создании трансгенных организмов.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова