План.

ВВЕДЕНИЕ.

1.БИОЧИПЫ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ XXI ВЕКА.

1.2. Биочипы определение.

1.3. Виды, свойства и функции биочипов.

2.Основная часть.

2.1. Гелевые биочипы, их свойства, производство и анализ.

2.2. Олигонуклеотиды и ДНКовые микрочипы.

2.3. Клеточные микрочипы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

БИОЧИПЫ В БИОЛОГИИ И

МЕДИЦИНЕ XXI ВЕКА.

Биологические микрочипы являются одним из наиболее быстро развивающихся экспериментальных направлений современной биологии. Существует два основных типа биочипов. Первый рассматриваемый тип - это микроматрицы различных соединений, главным образом биополимеров, иммобилизованных на поверхности стекла, в микрокаплях геля, в микрокапиллярах. Другим типом биочипов являются миниатюризованные "микролаборатории". Эффективность биочипов обусловлена возможностью параллельного проведения огромного количества специфических реакций и взаимодействий молекул биополимеров, таких как ДНК, белки, полисахариды, друг с другом и низкомолекулярными лигандами. Удается в достаточно простых параллельных экспериментах собрать и обработать на отдельных элементах биочипа огромное количество биологической информации. В этом заключается фундаментальное информационное сходство биочипов с электронными микрочипами. Однако между ними имеется и ряд принципиальных различий.

На рис. 1 показан принцип действия ячейки ДНК или олигонуклеотидного биочипа, основанный на комплементарных взаимодействиях основания аденина (А) с тимином (Т) и гуанина (G) с цитозином (С) в двух нитях ДНК. Если последовательность оснований в одной нити ДНК (или олигонуклеотида) полностью комплементарна последовательности другой нити, то образуется стабильная совершенная двухнитчатая спираль - дуплекс. Однако присутствие в дуплексе даже одной неправильной пары, например G-G, предотвращает образование дуплекса. Если иммобилизовать в одном из элементов микрочипа специфическую одноцепочечную ДНК или, положим, 20-мерный олигонуклеотид (пробу), то при добавлении к микрочипу меченных флюоресцентными красителями фрагментов ДНК, например генома человека, будет происходить их высокоспецифичное взаимодействие. Заданный олигонуклеотидный элемент биочипа специфически свяжет только одну комплементарную последовательность из 420 = 1.09 х 1012 всех возможных последовательностей этой длины в ДНК. В результате флюоресцентное свечение наблюдается только на этом комплементарном элементе биочипа. Таким образом, один элемент биочипа производит одну выборку примерно из триллиона возможных вариантов, в отличие от элемента электронного чипа, где происходит двоичная выборка: ДА или НЕТ.

Рис. 1. Схема образования двойной спирали ДНК на биочипе

Олигонуклеотид фиксирован на одном из элементов биочипа и избирательно связывает из многих флуоресцентно меченых фрагментов ДНК только комплементарный. В результате только этот элемент начинает светиться. Это происходит благодаря высоко-специфичным взаимодействиям комплементарных пар нуклеотидов А с Т и G с С. Присутствие некомплементарной пары, например G-G, предотвращает взаимодействие и оставляет элемент микрочипа темным

Стремительное развитие биологии во второй половине прошлого века тесно связано с появлением молекулярной и клеточной биологии, которая основана на концепции о редукционизме -сводимости сложных биологических процессов к процессам, протекающим на уровне отдельных молекул биополимеров, прежде всего белков и нуклеиновых кислот и их различных клеточных комплексов и структур. Редукционизму противопоставлялась концепция интегратизма о необходимости комплексного изучения структуры и функционирования в клетке всей совокупности макромолекул. В последние годы появились такие новые интегративные подходы, как геномика, протеомика и селломика, развиваемые большими коллективами или часто целыми "научными фабриками". Эти направления позволяют устанавливать структуру и изучать процессы на уровне генов всего генома, белков всей клетки или клеток всей ткани. Развиваемые в последние годы биологические микрочипы позволяют реализовать в доступной форме весьма сложные интегративные подходы геномики, протеомики и селломики. Например, олигонуклеотидные и ДНКовые микрочипы, выпускаемые рядом фирм, позволяют в достаточно простых, доступных отдельным исследователям экспериментах изучать экспрессию большинства генов различных бактерий и многих генов человека. На очереди создание белковых чипов, содержащих большое количество иммобилизованных клеточных белков или специфичных к ним антител.

Макроматрицы ДНК и белков иммобилизованных на фильтре, или фиксированных в лунках планшет, были известны достаточно давно. Однако первая работа по ДНКовым микрочипам и одна из первых по белковым микрочипам в современном формате были опубликованы нашей лабораторией в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ). Этот принципиальный скачок был предложен для использования в новом методе секвенирования ДНК гибридизацией. В 1968 г. Советский Союз, а вслед за ним США и другие страны приняли государственные программы установления полной последовательности всех 3 миллиардов нуклеотидов генома человека. Широко дискутировался вопрос, должна ли эта задача решаться масштабированием существующих подходов или должны быть разработаны новые, более эффективные методы. В связи с временными ограничениями, ученые пошли по пути существенного улучшения и гигантского масштабирования уже существующего метода, основанного на считывании одного нуклеотида за другим с конца коротких фрагментов ДНК. Этот метод в химическом и ферментативном варианте был предложен В. Гилбертом и Ф. Сенгером, которые и разделили Нобелевскую премию за 1967 г. В развитии химического метода большую роль сыграли академики Е.Д. Свердлов и А.Д. Мирзабеков. В своей Нобелевской речи В. Гилберт отметил, что "идея метода пришла только после второго визита А. Мирзабекова" в его лабораторию.

Рис. 2. Секвенирование фрагмента ДНК гибридизацией с полным олигонуклеотидным микрочипом, содержащим все 4096 6-меров

6-меры микрочипа, образующие при гибридизации с флуоресцентно меченым фрагментом ДНК совершенные дуплексы, интенсивно светятся. Такие соседствующие 6-меры перекрываются на пять нуклеотидов; это перекрывание позволяет однозначно восстановить нуклеотидную последовательность ДНК

В поисках новых подходов к секвенированию ДНК нами, а также независимо двумя другими группами в Англии и Сербии было предложено в 1988 г секвенирование гибридизацией. В этом методе секвенирование проводится не отдельными нуклеотидами, а словами в составе полного "словаря" нуклеотидных слов определенной величины. Такой словарь может содержать все возможные 4096 гексануклеотидов, т.е. шестибуквенных генетических слов. Для нас стала очевидной необходимость создания микрочипов, и в следующем году появилась первая статья, описывающая приготовление и свойства предложенных нами гелевых микрочипов. Позднее нами были созданы полные микрочипные гексануклеотид-ные словари. С этого момента и по настоящее время наша группа сконцентрировалась на развитии биочипов: создании ДНКовых, белковых и клеточных биочипов, на развитии технологий их производства и на их применении в фундаментальных исследованиях и их различных приложениях в медицине, биотехнологии и др. областях. Эти исследования рассмотрены в обзорной работе.

Рис. 2 показывает такой полный 6-мерный олигонуклеотидный микрочип и секвенирование на нем 50-нуклеотидного фрагмента ДНК. Для приведенного случая идентификация всех 6-меров, комплементарных к ДНК, и перекрывание соседних 6-меров на пять нуклеотидов позволяет восстановить полную нуклеотидную последовательность ДНК. В действительности метод в данном варианте работает только в части случаев, его широкому применению должно предшествовать решение ряда экспериментальных проблем, которые будут рассмотрены далее. .

ГЕЛЕВЫЕ БИОЧИПЫ, ИХ СВОЙСТВА, ПРОИЗВОДСТВО И АНАЛИЗ

Своеобразием и отличием развиваемых нами биочипов является то, что они представляют собой полусферические капли гидрогеля, фиксированные химической связью на поверхности стекла, пластика или силикона. Различные биомолекулы равномерно распределяются и иммобилизуются химическими связями в объеме геля. Иммобилизация не на двумерной поверхности, а в трехмерном объеме геля дает ряд существенных преимуществ. В десятки и сотни раз увеличивается емкость биочипа на единицу поверхности и соответственно увеличивается чувствительность измерений. Иммобилизованные макромолекулы как бы фиксированы в гомогенной водной среде, составляющей около 95% объема геля. Это исключает их взаимодействие как друг с другом, так и с твердой поверхностью, где гетерофазные процессы с участием фиксированных на ней биомолекул протекают более сложным образом. Это особенно существенно для белковых чипов, поскольку молекулы белков имеют тенденцию денатурации в интерфазе, образованной между твердой поверхностью и водной средой. Наконец, гелевые элементы на воздухе или под маслом превращаются как бы в изолированные микро- и нанолитровые пробирки, в каждой из которых можно проводить индивидуально различные специфические взаимодействия, химические и ферментативные реакции. Благодаря этому гелевые биочипы объединяют в себе свойства и микроматриц и микролабораторий.

Технология производства гелевых биочипов прошла три этапа развития.

Громоздкая и малоэффективная технология первого поколения состояла из пяти стадий и была разработана и запатентована в ИМБ в 1989-1993 гг. Она была перенесена в совместную биочипную лабораторию, организованную ИМБ и Аргонской национальной лабораторией (АНЛ, США) в 1994-2000 гг. и стала технологией первого поколения, была лицензирована американскими фирмами "Моторолой" и "Пакардом". Однако из-за ее несовершенства фирмы стали производить биочипы не как микроматрицы гелевых элементов, а как сплошную поверхность полиакриламидного геля.

В ИМБ за последние три года разработаны технологии производства биочипов второго и третьего поколения. Технология второго поколения состоит из трех этапов: модификация иммобилизуемых биополимеров мономерными группами геля, нанесение раствора этих веществ в смеси с мономерными звеньями геля с помощью игольчатого или пьезоэлектрического робота и, наконец, фотоиндуцированная сополимеризация свободных и связанных с биополимерами молекул мономера. Это приводит к равномерной иммобилизации веществ во всем объеме геля. В еще более простой двухэтапной технологии третьего поколения первая и третья стадии получения биочипов объединены с помощью своеобразной химической реакции.

Достаточно простая, универсальная и дешевая технология третьего поколения позволяет производить даже в лабораторных условиях сотни и в скором будущем тысячи олигонуклеотидных, ДНКовых или белковых микрочипов в день. Разработан также метод получения сополимеризацией микрочипов с размерами гелевых микроячеек до 5х5х5 мкм. Биочипы содержат от десятков до нескольких тысяч гелевых элементов с иммобилизованными в них соединениями. Элементы микрочипа представляют собой гидрогелевые полусферы (диаметром около 100 мкм), находящиеся на расстоянии 250 мкм друг от друга на гидрофобизованной поверхности стекла. Одноцепочечные ДНК длиной до 200-300 нуклеотидов и белки с массой до 150 кД легко и достаточно быстро диффундируют в гидрогелевые элементы микрочипов специально разработанного состава. Сам биочип помещен в реакционную камеру с капиллярным входом и выходом, в которой можно проводить различные процессы в строго контролируемых условиях.

АНАЛИЗ БИОЧИПОВ

Регистрация происходящих на биочипах процессов осуществляется с помощью флюоресцент-ных, а также в некоторых случаях хемилюминис-центных и масс-спектрометрических методов. Для количественного флюоресцентного анализа нами были разработаны совместно с РНЦ "Государственный оптический институт им. С.И. Вавилова" флюоресцентные широкопольные высоко-апертурные микроскопы, снабженные ПЗС-камерой и компьютером. Прибор позволяет проводить в реакционной камере количественный анализ в реальном времени сразу всех элементов биочипа в автоматическом режиме, одновременно при четырех длинах волн, при заданной или меняющейся температуре. Более 20 таких достаточно дорогих исследовательских анализаторов биочипов поставлены в лаборатории России и США. Для клиник нами разработан более простой и дешевый лазерный анализатор. Он позволяет проводить количественную регистрацию флюоресценции одновременно со всего биочипа с помощью более простой ПЗС-камеры и обрабатывать результаты на прилагаемом портативном компьютере с помощью специально созданных программ.

Хемилюминисцентные методы, хотя и уступают по чувствительности люминесцентным, позволяют значительно упростить и удешевить регистрирующую аппаратуру. Кроме того, разработан специальный метод прямого анализа соединений непосредственно в гелевых элементах с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии. Этот важный в протеомике метод позволяет проводить дополнительную идентификацию взаимодействующих с биочипами соединений по их массе.

ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ И ДНКовые МИКРОЧИПЫ

Процесс комплементарных взаимодействий двух нитей ДНК (гибридизация) осложняется существенно меньшей стабильностью совершенного дуплекса А-Т по сравнению с G-C дуплексом и неодинаковым дестабилизирующим эффектом различных неправильных пар оснований. Поэтому в некоторых типах экспериментов была введено измерение кривых плавления, то есть количественной регистрации флюоресценции параллельно во всех ячейках микрочипа в градиенте повышающейся температуры. Это позволяет вычислить термодинамические параметры образования дуплексов: свободную энергию, энтропию и энтальпию. Проведение таких исследований на производимых нами микрочипах, содержащих всевозможные 6-мерные нуклеотиды (всего их 4096), открывает уникальные возможности. Сейчас измеряются термодинамические параметры для 4096 совершенных гексамерных дуплексов и 73728 дуплексов, содержащих всевозможные неправильные пары оснований во всех положениях гексануклеотидов. Составление полного каталога термодинамических параметров гексамерных дуплексов позволит создать более точную теорию гибридизации и оценить влияние на гибридизацию первичной и вторичной структур в ДНК. Эта теория необходима для практических работ с ДНК и, в свою очередь, будет способствовать завершению развития метода секвенирования ДНК гибридизацией.

Для широкого применения секвенирования ДНК гибридизацией с полными, например 6-мерными или более сложными, микрочипами требуется решение ряда проблем. Важной задачей является надежная дискриминация совершенных и неправильных дуплексов, образующихся на био-чипе, что затруднено различиями в стабильности А-Т и G-C пар оснований. Измерение кривых плавлений дуплексов и применение алгоритмов, вычисляющих поверхность под кривой плавления для каждого дуплекса, увеличивают надежность анализа. Другим серьезным препятствием является частое присутствие в ДНК повторяющихся гексануклеотидных и более длинных последовательностей. Эту частоту можно оценить количественно, измеряя и сравнивания интенсивности флуоресценции различных элементов биочипа.

Гибридизация с полным 6-мерным биочипом становится привлекательным методом для выявления известных и открытия новых мутаций и нуклеотидного полиморфизма в участках ДНК с известной структурой. Последовательная гибридизация с одним и тем же полным биочипом двух фрагментов одного и того же участка генома с известной и анализируемой структурой позволяет выявить различия во флюоресцентной картине и установить структуру и положение измененного основания в ДНК. Таким методом можно выявлять присутствие патогенных мутантов в стандартном штамме полиовируса, используемого как полиомиелитная вакцина.

Полные 6-мерные биочипы были также использованы для выявления специфичности ДНК-связывающихся соединений к определенным нуклеотидным последовательностям. Таким способом была изучена специфичность гистоноподоб-ного бактериального белка HU, низкомолекулярного красителя Хекст 33258, а также белка р50, являющегося регулятором транскрипции и трансляции и открытого группой академика Л.П. Овчинникова (рис. 3).

Рис. 3. Идентификация узнавания белком Р50 специфичных участков в ДНК

Флуоресцентно окрашенный белок Р50 связывается с полным 6-мерным олигонуклеотидным микрочипом. Проводиться измерение флуоресценции белка на каждом элементе биочипа в градиенте повышающейся температуры и ТD -температур плавления комплексов белка с олигонуклеотидами. Олигонуклеотиды микрочипа, проявляющие наибольшую температурную стабильность в комплексе с ДНК, локализованные в светлом кресте и содержащие тетрануклеотидные последовательности TGGT и GGTC, демонстрируют также и наибольшую специфичность связывания

Гибридизация с олигонуклеотидными микрочипами служит для качественной и количественной идентификации нуклеиновых кислот и для анализа структурных вариаций в них. Рибосомы присутствуют во всех живых клетках, а рибосомальные РНК являются одними из наиболее эволюционно консервативных макромолекул. Вместе с тем в рибосомальных РНК существуют несколько вариабельных участков. Различия в нуклеотидной последовательности этих участков применяются для идентификации микроорганизмов и для прослеживания их эволюции. Нами разработан ряд микрочипов для экспрессного метода идентификации нитрифицирующих бактерий, бактерий групп Bacillus и архебактерий. Присутствие рибосомальных РНК в клетке в количестве тысяч копий позволяет проводить анализ в ряде случаев без их амплификации. Разработана также простая система выделения рибосомальных РНК и их флюоресцентного мечения на одной и той же колонке, что позволило создать биочипный экспресс-метод анализа таких типов биологического оружия, как сибирская язва. Мы изучаем также возможность создания биогенов для идентификации всех или большей части известных микроорганизмов.

Для качественного и количественного анализа экспрессии генов и содержания различных информационных РНК существует несколько зарубежных коммерческих биочипных систем. Гелевые микрочипы были использованы нами также для анализа мРНК, например, для идентификации хромосомных перестроек, вызывающих восемь различных типов лейкемий. Соответствующая микрочипная диагностика лейкемий внедрена в Детском республиканском гематологическом центре.

Олигонуклеотидные микрочипы являются эффективным подходом для одновременной идентификации от десятков до тысяч генов и их структурного анализа, для выявления специфичных нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных вариаций в их структуре. Однако когда гены присутствуют в геноме в количестве одной или нескольких копий, требуется их предварительная амплификация. Наиболее эффективным методом амплификации ДНК является полимеразная цепная реакция, в процессе которой происходит экспоненциальное увеличение количества молекул ДНК от нескольких до миллионов и более копий, достаточных для проведения их гибридизационного анализа.

В более традиционном и простом подходе амплификация ДНК и гибридизация амплифицированной ДНК с биочипом проводятся в две отдельные стадии. Такие двухстадийные методы были разработаны нами в совместных исследованиях с рядом российских и зарубежных лабораторий для идентификации мутаций в b-глобиновом гене, вызывающем наследственное заболевание b-талассемию, определения аллелей в гене гистосовместимости HLA DQAI, нуклеотидного полиморфизма в гене m-опиоидного рецептора, обуславливающего, вероятно, склонность к наркомании, определения ряда бактериальных генов, ответственных за резистентность к антибиотикам и синтез некоторых токсинов.

Гибридизация амплифицированной ДНК с reлевыми биочипами нашла применение в практике для идентификации мутаций, ответственных за резистентность туберкулезных бацилл к одному из основных противотуберкулезных препаратов - рифампицину. Этот метод прост, недорог и ускоряет анализ от нескольких недель до 1 дня. Метод был разработан совместно с Московским научно-практическим центром борьбы с туберкулезом и ГНЦ вирусологии и биотехнологии "Вектор" и опробован более чем на 150 больных в ряде клиник. Налажен коммерческий выпуск таких наборов для анализа, содержащих олигонуклеотидные микрочипы, компоненты для амплификации ДНК, включая синтетические флюоресцентно меченные олигонуклеотиды, клинический анализатор биочипов с портативным компьютером и программой для автоматического анализа биочипов. Этот метод нетрудно адаптировать для обнаружения многих других микроорганизмов, генов лекарственной резистентности и синтеза токсинов, а также для идентификации различных мутаций в вирусах, микроорганизмах, животных (включая человека) и растениях. Введение соответствующих изменений, необходимых для выполнения этих задач, можно провести за короткое время - от нескольких недель до нескольких месяцев.

В двух других разработанных методах гибридизацию на микрочипе объединяют с амплификацией на микрочипе в одну стадию, что ускоряет и упрощает анализ. Во втором методе амплификация происходит параллельно в растворе в реакционной камере и в гелевых элементах микрочипа, содержащих иммобилизованные и участвующие в амплификации олигонуклеотиды (праймеры). Такой подход был был использован для сокращения идентификации туберкулезной бациллы до 2 часов и определения ее резистентности сразу к двум лекарственным препаратам - рифампицину и изониазиду. В методе используется также аллель-специфичная амплификация, протекающая на иммобилизованных в геле олигонуклеотидах. Помимо этого, мутации и полиморфные нуклеотиды могут выявляться с помощью ферментативных реакций удлинения иммобилизованных на чипе олигонуклеотидов на один нуклеотид и их соединения с другими олигонуклеотидами - лигирования.

В третьем методе амплификация происходит исключительно в гелевых элементах микрочипа, используемых в этом случае как пробирки объемом от нескольких нанолитров до долей микролитра. Каждая из этих гелевых нанопробирок содержит необходимые для амплификации два и более специфических олигонуклеотида. Метод пока достаточно сложен в исполнении и требует дальнейшей доработки. Однако его реализация позволит анализировать на одном биочипе и в одном эксперименте тысячи полиморфных нуклео-тидов в геноме, что позволит использовать его для массового скрининга популяций. Известно, что полиморфизм примерно 3 млн. нуклеотидов из 3 млрд., составляющих человеческий геном, отличает одного человека от другого. Полиморфизм отвечает за наследственные дефекты и патологии, предрасположенность ко многим заболеваниям, в том числе злокачественным, и определяет многие Другие генетически заданные особенности человека. Поэтому создание простого и эффективного микрочипного анализа полиморфизма сразу по многим участкам для каждого индивидума приблизит человека к цели "Познай самого себя", начертанной приблизительно 2500 лет назад на стене Дельфийского храма в Греции.

Биочипы, разработанные для идентификации некоторых патогенных бактерий, вирусов и биологического оружия, а также для обнаружения мутаций, вызывающих раковые заболевания а - вируса натуральной оспы, осповакцины, оспы коров;

б - сибирской язвы, чумы, бруцеллеза на одном чипе;

в - детекция патогенов в донорской крови;

г - мутации в ген brcal, ответственных за возникновение рака молочной железы;

д - транслокаций при лейкозах

Некоторые из этих биочипов могут быть использованы для быстрого и чувствительного выявления биологического оружия, оспы, сибирской язвы и других подобного рода болезней.

Технология производства микрочипов позволяет с небольшими изменениями получать как олигонуклеотидные и ДНКовые, так и белковые микрочипы, содержащие ферменты, антитела, антигены и т.д. Стабилизирующий эффект иммобилизации в геле позволяет хранить большинство белковых микрочипов в течение месяцев без потери функциональной активности.

В сотрудничестве с лабораториями членов-корреспондентов РАН Е.В. Гришина и В.А. Несмеянова (ИБХ, РАН), а также А.Ю. Барышникова (Онкоцентр РАМН) нами было продемонстрировано эффективное применение белковых гелевых чипов для количественной диагностики ряда токсинов, а также раковых антигенов и антител в крови пациентов. Эти начальные эксперименты свидетельствуют, что биочипы конкурентоспособны в клинической иммунодиагностике со стандартными методами.

Перспективно использование белковых чипов в бурно развивающейся протеомике. В этой связи особый интерес представляют следующие две задачи:

Качественное и количественное определение параллельно большого количества белков в клетках различных тканей или в различных функциональных состояниях, для чего можно использовать специфические антитела, как продемонстрировано на рис. 7, для количественной идентификации антигена рака простаты; в ряде стран уже развернуты программы получения большинства белков человеческих и бактериальных клеток и производства специфических антител к ним; мы надеемся использовать отечественную биочипную технологию для сотрудничества с этими программами с целью создания системы количественного определения клеточных белков;

Изучение взаимодействий клеточных белков друг с другом и другими клеточными лигандами, такими как ДНК и низкомолекулярные соединения; определение специфичности ДНК связывающихся белков с помощью полных олигонуклеотидных микрочипов описано ранее; значительно более сложной задачей является идентификация белков, специфически взаимодействующих друг с другом и лигандами, если хотя бы один компонент неизвестен; для этих случаев разработан метод идентификации связывающихся с микрочипом молекул с помощью масс-спектрометрии; на белковых микрочипах, содержащих иммобилизованные ферменты, можно проводить также кинетический анализ их субстратов и ингибиторов.

КЛЕТОЧНЫЕ МИКРОЧИПЫ

Многие прокариотические и эукариотические клетки, как известно, сохраняют свою жизнедеятельность и даже могут делиться, будучи фиксированы в гидрогеле. Это открывает ряд интересных возможностей, в том числе для создания клеточных биочипов как матричных биосенсоров для параллельного определения, например, ряда антибиотиков и ксенобиотиков. Бактериальный микрочип, содержащий иммобилизованные и резистентные к различным антибиотикам штаммы Е. сoli. Фотография прокрашенного гелевого элемента свидетельствует о распределении растущих клеток по всему объему геля. Кинетика деления и роста бактерий в геле микрочипа регистрируется окрашиванием клеток флюоресцентной краской. Рост бактерий зависит от резистентности клеток к антибиотику и его присутствия в среде. Рисунок показывает бактериальный микрочип, содержащий иммобилизованные в геле 4 штамма Е. coli, чувствительные и резистентные к антибиотикам тетрациклину, хлорамфениколу и смеси хлорамфеникола и ампициллина. Подавление роста бактерий в соответствующих элементах биочипа позволяет идентифицировать присутствие этих антибиотиков в среде. После построения калибровочной кривой содержание антибиотиков в среде может быть измерено количественно. Представляет интерес также создание микрочипов, содержащих животные и растительные клетки для определения широкого диапазона различных веществ в окружающей среде.

Открытие функционального значения тысяч генов и молекулярных механизмов действия множества ферментов стало революционным событием в биологии, оказавшим и продолжающим оказывать огромное влияние на развитие медицины XXI в. Перед учеными и медиками открылись уникальные возможности для выяснения причин многих инфекционных и наследственных заболеваний, а также разработки эффективных методов их лечения. В свою очередь, развитие новых диагностических методов потребовало и создания новых технологий многопараметрического анализа биологических образцов, с помощью которых можно одновременно исследовать множество белковых и ДНК-маркеров различных заболеваний, функционально-значимых биологических макромолекул и их комплексов. Так появилась технология биологических микрочипов, способных, подобно микрочипам электронным, извлекать и обрабатывать огромные массивы информации из одного небольшого образца биологического материала, полученного от конкретного пациента.

За последние десятилетия был накоплен огромный объем знаний о молекулярных основах биохимических процессов в живых организмах. Это дало возможности не только точно диагностировать то или иное заболевание, но и оценить вероятность его возникновения еще до проявления у пациента клинических симптомов, а также подобрать эффективную терапию. Подавляющую часть такой информации получают с помощью лабораторной диагностики, на которую в мире ежегодно расходуется свыше 100 млрд долларов. В России в 1970 г. она насчитывала 81 биохимический / молекулярный тест, в 2000 г. - 170, а сегодня число тестов измеряется тысячами!

Большинство важнейших современных методов молекулярной диагностики основано на анализе данных, полученных при исследовании структуры геномов человека и микроорганизмов. В первую очередь речь идет о полимеразной цепной реакции (ПЦР). Обычно ДНК содержится в образцах в минимальных количествах, однако с помощью ПЦР можно в миллионы раз «размножить» в исследуемой пробе биоматериала определенные фрагменты этих макромолекул. «Мишенями» могут служить бактериальные или вирусные гены, генетические маркеры раковых опухолей и т. п. С помощью этого метода можно определить наличие, к примеру, возбудителя болезни, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул его ДНК.

Однако возможности методов, базирующихся на ПЦР, ограничены в случае, когда речь идет об одновременном анализе десятков и сотен различных биомаркеров. И здесь на первый план выходит уже успешно зарекомендовавшая себя технология биологических микрочипов (биочипов). Достоинство этой технологии в том, что тест проводится в формате «один образец - один реакционный объем биочипа», т. е. образец не нужно разделять на несколько частей и их отдельно анализировать. Такой формат намного повышает чувствительность анализа и снижает его трудоемкость и стоимость, что дает возможность клинико-диагностическим лабораториям тестировать десятки и сотни образцов за одну рабочую смену.

Сегодня ведущие научные журналы регулярно публикуют обзоры, посвященные биологическим микрочипам, которые производят многие десятки компаний, а объем продаж составляет сотни миллионов долларов в год. Вместе с тем сама идея создания биочипов родилась лишь четверть века назад, и одним из мест рождения этой технологии стал Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук.

С самого начала подход российских исследователей отличался удачным выбором ключевых технологических решений, благодаря которым технологии биочипов ИМБ РАН продолжают оставаться конкурентоспособными в мировой науке. Многие из этих подходов (например, замена радиоактивных меток на флуоресцентные, применение гидрогеля и элементов сферической формы) стали использовать в своей работе другие исследователи, занимающиеся разработкой биочипов. А с 2000 г. в ИМБ РАН при поддержке Международного научно-технического центра начались работы по созданию биочипов для медицинской диагностики возбудителей социально значимых заболеваний.

Биочипы в деле

Главным элементом любого биочипа служит матрица из сотен и тысяч микроячеек, каждая из которых содержит так называемые молекулярные зонды - молекулы, способные специфично связываться только со строго определенными биологическими молекулами или их фрагментами. Зондами могут служить олигонуклеотиды, участки геномной ДНК, РНК, антитела, олигосахариды, различные низкомолекулярные соединения и др. Каждая ячейка биочипа служит своего рода отдельной «нанопробиркой», где иммобилизованный зонд распознает в анализируемом образце только свою мишень. Таким образом удается проводить параллельное распознавание сразу множества мишеней, например, генов, ответственных за лекарственную устойчивость возбудителя болезни.

Принципиальное отличие технологии матричных биочипов, разработанной в ИМБ РАН, в том, что зонды располагаются не на плоской подложке, а в заполимеризованных «каплях» гидрогеля полусферической формы. Размещение молекулярных зондов в трехмерном объеме, а не на плоскости, дает ряд существенных преимуществ. Оно позволяет в десятки и сотни раз увеличить емкость биочипа на единицу поверхности и, соответственно, чувствительность измерений. Кроме того, гель - насыщенное водой желеобразное вещество, исключает возможность взаимодействия зондов друг с другом и с твердой поверхностью подложки, а также обеспечивает отличную изоляцию отдельных ячеек на биочипе.

Для регистрации результатов анализа используют флуоресцентные метки, которые вводят в молекулы образца. Если зонд специфично распознает и свяжется с мишенью, в ячейке возникает флуоресценция . Интенсивность свечения ячеек биочипа измеряется с помощью специальных аппаратно-программных комплексов-анализаторов, которые и выдают отчет о присутствии в исследуемом образце специфичных молекулярных мишеней, информирующих о наличии микроорганизмов или генных мутаций, онкомаркеров или аллергенов и т. п.

Оригинальная технология создания таких гелевых чипов, разработанная в ИМБ РАН, была запатентована и сертифицирована по европейским стандартам. Биочипы, созданные по этой технологии, занимают отдельную нишу диагностических микроматриц и применяются в российских клиниках. Коммерческие микроматрицы, произведенные ведущими научно-производственными корпорациями Германии и США применяются, в основном, в исследовательских целях.

Россия - пионер «биочипостроения»

Большие матрицы с ДНК и белками, иммобилизованными на фильтре или зафиксированными в лунках планшета, были известны достаточно давно. Но идея о создании микрочипов современного формата появилась лишь в конце прошлого века. Первая работа по ДНК-микрочипам и одна из первых - по белковым чипам были опубликованы группой академика А. Д. Мирзабекова из московского Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта АН СССР (Khrapko et al. , 1989; Arenkov et al., 2000).

Эта революционная идея родилась как предложение для нового метода секвенирования ДНК с использованием гибридизации - процесса объединения двух комплементарных одноцепочечных молекул ДНК в двуцепочечную. Работы по совершенствованию методик секвенирования были стимулированы все более возраставшим интересом к проблеме расшифровки генома человека.

В то время в научной среде широко дискутировался вопрос, должна ли эта задача решаться масштабированием существующих подходов или нужно разрабатывать новые, более эффективные. Ученые сначала пошли по первому пути. Так, в 1977 г. появился «метод Сенгера», основанный на ферментативном синтезе комплементарной последовательности ДНК на матрице анализируемой одноцепочечной ДНК, а его разработчики получили в 1980 г. Нобелевскую премию. В своей нобелевской речи один из лауреатов, американский биохимик У. Гилберт, отметил, что «идея метода пришла только после второго визита А. Мирзабекова» в его лабораторию (Gilbert, 1984).

При секвенировании гибридизацией «расшифровка» ДНК идет не отдельными буквами-нуклеотидами, а «словами» определенной величины, и такой словарь может содержать тысячи слов. Стала очевидной необходимость создания микрочипов: в это время и вышла первая статья ученых из ИМБ, где были описаны приготовление и свойства гелевых микрочипов (Khrapko et al., 1989).

Технология производства гелевых биочипов прошла несколько этапов развития. Технология первого поколения, еще достаточно громоздкая и несовершенная, была разработана и запатентована в ИМБ в 1989–1993 гг., а впоследствии реализована в совместной лаборатории, организованной институтом и Аргоннской национальной лабораторией (США), и лицензирована американскими компаниями Motorola и Packard Instruments . Однако из-за технологических проблем фирмы стали производить биочипы, матрица которых представляла собой поверхность, сплошь покрытую полиакриламидным гелем.

В ИМБ РАН технология гелевых биочипов продолжала развиваться. Современная, достаточно простая, универсальная и дешевая технология позволяет производить даже в лабораторных условиях сотни и тысячи олигонуклеотидных, ДНКовых или белковых микрочипов в день (Колчинский и др., 2004).

Туберкулез и лекарственная устойчивость

Первой в мире тест-системой на основе биочипов, зарегистрированной для медицинского применения, стал разработанный в ИМБ в 2004 г. набор «ТБ-Биочип-1». С его помощью можно определить наличие в геноме микобактерии туберкулеза 47 мутаций, приводящих к устойчивости к двум основным противотуберкулезным препаратам - рифампицину и изониазиду .

Почему внимание исследователей привлек именно туберкулез? Дело в том, что многие десятилетия для борьбы с этой болезнью использовали комбинированное лечение сразу несколькими химиопрепаратами, чтобы повысить его эффективность. При монотерапии больные быстро приобретали устойчивость к лекарству. Однако такая стратегия привела к тому, что уже в конце прошлого века в мире, в том числе и в России, начал повсеместно распространяться туберкулез со множественной лекарственной устойчивостью . Именно этот фактор в наши дни чаще всего является причиной неудачного исхода лечения и возникновения рецидива болезни, от которой ежегодно в мире умирает более 3 млн человек.

Изониазид и рифампицин относятся к популярным и наиболее эффективным препаратам первого (основного) ряда. И если выделенный от пациента возбудитель окажется устойчивым к этим лекарствам, нужно обращаться к химиопрепаратам второго (резервного) ряда, к которым будет чувствительна эта бактериальная популяция. Сегодня одними из наиболее перспективных препаратов для лечения таких форм туберкулеза являются фторхинолоны . Поэтому следующей тест-системой в ряду диагностических тестов ИМБ стал «ТБ-Биочип-2», с помощью которого можно выявить лекарственную устойчивость к различным классам этих препаратов (Грядунов и др., 2009).

Все более широкое распространение форм туберкулеза со множественной лекарственной устойчивостью явилось стимулом для дальнейшей «эволюции» тест-системы. Требовалось, во-первых, максимально охватить весь спектр генетически детерминированной резистентности к широкому ряду противотуберкулезных препаратов. Во-вторых, возникла необходимость определять генотип и соответственно принадлежность выделенного штамма к основным семействам, циркулирующим на территории РФ, что важно не только для эпидемиологического мониторинга структуры популяции возбудителей туберкулеза, но и для назначения адекватной терапии.

Так в 2012–2013 гг. в результате масштабных геномных исследований был создан не имеющий мировых аналогов набор реагентов «ТБ-ТЕСТ», позволяющий одновременно идентифицировать 120 генетических локусов, отвечающих за развитие устойчивости к препаратам первой и второй «линии обороны»: рифампицину, изониазиду, этамбутолу, фторхинолонам и инъекционным препаратам (амикацину и капреомицину) (Zimenkov et al., 2016). Такая диагностика позволяет дифференцированно назначать высокие дозы химиопрепаратов или, напротив, удалять те или иные лекарства из схем терапии.

Чтобы получить государственную регистрацию в Росздравнадзоре, тест-система прошла все виды испытаний и экспертиз и с 2014 г. разрешена к применению в медицинской практике РФ. В настоящее время «ТБ-ТЕСТ» приходит на смену наборам «ТБ-Биочип».

От гепатита до рака и аллергий

Еще одной актуальной проблемой мирового здравоохранения является лечение больных гепатитом С. Возбудитель этого вирусного заболевания может долгое время размножаться в печени, ничем не выдавая себя, а первые признаки болезни обнаруживаются лишь спустя пару месяцев после заражения. Еще недавно гепатит С считался практически неизлечимой болезнью, а основным терапевтическим средством служила комбинация из интерферона и рибавирина , которая зачастую оказывалась неэффективной и имела много негативных побочных эффектов.

Сегодня созданы новые антивирусные препараты, обладающие так называемым прямым противовирусным действием и блокирующие ключевые внутриклеточные этапы размножения возбудителя. Но вся сложность в том, что вирус гепатита С имеет 7 вариантов генотипа, при этом каждый генотип имеет еще несколько подтипов. Более того, разные генотипы / подтипы обладают и разной чувствительностью к традиционным и новым препаратам, и выбор противовирусной терапии должен проводиться в соответствии с генотипическими особенностями возбудителя.

В ИМБ РАН совместно с лабораторией вирусологии госпиталя Университета г. Тулузы (Франция) был разработан и запатентован не имеющий мировых аналогов подход, основанный на использовании платформы гидрогелевых биочипов для типирования вируса гепатита С на основе анализа области NS5B вирусного генома. Тест-система «HCV-Биочип», способная определять 6 генотипов и 36 подтипов этого вируса, успешно прошла клинические испытания в России и Франции (Gryadunov et al., 2011).

Важнейшим направлением приложения технологии гидрогелевых биочипов служит анализ мутаций и полиморфизмов ДНК самого человека: ДНК-маркеров, ассоциированных с возникновением различных неинфекционных заболеваний.

Среди онкологических заболеваний у детей ведущее место занимают лейкозы. Тест-система «ЛК-Биочип» способна идентифицировать в образцах крови 13 наиболее клинически значимых хромосомных транслокаций (переносов фрагмента одной хромосомы на другую), характерных для некоторых типов острых и хронических лейкозов. Каждая из этих транслокаций определяет свой вариант развития лейкоза и важна для выбора стратегии лечения. Эта тест-система применяется в Национальном научно-практическом центре детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева (Москва), где анализируются образцы из 18 региональных гематологических центров РФ (Gryadunov et al. , 2011).

Для ранней диагностики рака молочной железы и яичников создана тест-система «РМЖ-Биочип», которая позволяет определять мутации в генах BRCA1/2, ассоциированные с высокой (до 80%) вероятностью возникновения наследственных форм этих заболеваний.

В настоящее время в ИМБ РАН разрабатываются варианты тест-систем на основе биочипов для определения чувствительности злокачественных клеток к противоопухолевой терапии. Например, с помощью биочипа для индивидуального подбора препаратов, эффективно воздействующих на молекулярные мишени в опухолевых клетках меланомы, можно выявить мутации генов, которые определяют целесообразность использования таких препаратов таргетной («молекулярно-прицельной») терапии поздних стадий и рецидивов меланомы, как траметиниб , иматиниб и вемурафениб (Emelyanova et al., 2017).

Трехмерная структура гидрогеля, в котором на биочипах зафиксированы молекулярные зонды, позволяет сохранить без изменений достаточно «чувствительную» нативную структуру белковых молекул. Поэтому такие биочипы можно использовать также для исследования белок-белковых взаимодействий, что требуется, к примеру, при проведении различных видов иммунохимического анализа.

В ИМБ РАН удалось перевести такой классический анализ в формат микрочипа и адаптировать его для диагностики аллергических заболеваний. Совместно с германской биотехнологической компанией Dr. Fooke Laboratorien GmbH , предоставившей наборы природных и рекомбинантных аллергенов, была разработана и запатентована тест-система «Аллерго-Биочип» для параллельного количественного определения больших панелей аллерген-специфичных антител Е и G4 в сыворотке крови (Feyzkhanova et al., 2017).

Важно, что для анализа антител на 30 и более аллергенов на биочипе требуется очень небольшой (всего 60 мкл) объем сыворотки крови - ровно столько, сколько требуется для анализа на один аллерген традиционным иммуноферментным методом! Такое отличие особенно значимо в педиатрии. Лабораторный вариант этой тест-системы уже проходит доклинические испытания в Детской городской клинической больнице № 13 им. Н. Ф. Филатова (Москва).

Двенадцать специализированных тест-систем, созданных на основе технологии гидрогелевых биочипов в ИМБ РАН, получили разрешение к применению как медицинские изделия для лабораторной диагностики. Эти тест-системы успешно используются более чем в 50 научно-исследовательских и медицинских центрах РФ, стран СНГ и ЕС.

Технологии биочипов, разработанные в ИМБ РАН, защищены 42 отечественными и международными патентами. И эти технологии продолжают интенсивно развиваться. Разрабатываются новые подходы, позволяющие упростить и ускорить методики, интегрировать в единую процедуру все стадии проведения анализа: от обработки биологического образца до количественной идентификации в режиме реального времени.

Ядро системы - гидрогелевый биочип - будет в дальнейшем модифицироваться в зависимости от назначения диагностического теста, в то время как остальные компоненты уже сейчас являются унифицированными. Такие «лаборатории на чипе» позволят значительно улучшить качество лабораторной диагностики, снизить вероятность заражения медперсонала и в конечном счете повысить эффективность и сократить стоимость лечения.

Литература
1. Грядунов Д. А., Зименков Д. В., Михайлович В. М. и др. Технология гидрогелевых биочипов и ее применение в медицинской лабораторной диагностике // Медицинский алфавит. 2009. № 3. С. 10–14.
2. Заседателев А. С. Биологические микрочипы для медицинской диагностики // Наука и технологии в промышленности. 2005. № 1. С. 18–19.
3. Колчинский А. М., Грядунов Д. А., Лысов Ю. П. и др. Микрочипы на основе трехмерных ячеек геля: история и перспективы // Молекулярная биология. 2004. Е. 38. № 1. С. 5–16.
4. Arenkov P., Kukhtin A., Gemmell A., et al. Protein microchips: use for immunoassay and enzymatic reactions // Analytical Biochemistry . 2000. V. 278. N. 2. P. 123–131.
5. Emelyanova M., Ghukasyan L., Abramov I. et al. Detection of BRAF, NRAS, KIT, GNAQ, GNA11 and MAP2K1/2 mutations in Russian melanoma patients using LNA PCR clamp and biochip analysis // Oncotarget . 2017. V. 32. N. 8. P. 52304–52320.
6. Feyzkhanova G., Voloshin S., Smoldovskaya O. et al. Development of a microarray-based method for allergen-specific IgE and IgG4 detection // Clinical proteomics . 2017. doi: 10.1186/s12014-016-9136-7.
7. Gryadunov D., Dementieva E., Mikhailovich V. et al. Gel-based microarrays in clinical diagnostics in Russia // Expert review of molecular diagnostics. 2011. N. 11. P. 839–853.
8. Khrapko K. R., Lysov Yu. P., Khorlyn A. A. An oligonucleotide hybridization approach to DNA sequencing // FEBS Letters . 1989. V. 256. N. 1-2. P. 118–122.
9. Zimenkov D. V., Kulagina E. V., Antonova O. V., et al. Simultaneous drug resistance detection and genotyping of Mycobacterium tuberculosis using a low-density hydrogel microarray // Journal of antimicrobial chemotherapy . 2016. V. 71. N. 6. P. 1520–1531.

Каждый из нас проходил обследования в клиниках и имеет представление о том, как много времени и сил они отнимают. Сдавать кучу анализов, литры крови, далее терпеть недельное ожидание, чтобы врачи успели в своих лабораториях проверить наши пробирки на наличие бактерий и вирусов. Однако, в скором времени все может в корне измениться, и обследования больше не будут пугать людей. Что поможет проводить диагностику всех заболеваний в разы быстрее?

Около двадцати лет назад была разработана технология биологических чипов . Данная разработка принадлежит Институту молекулярной биологии им. Энгельгардта. Можно сказать, что в течение всех этих двадцать лет разработка пылилась на полках и ей никто не занимался. Но сейчас ученые решили вновь возобновить работу над чипами и в ближайшем будущем собираются изготовить целую серию чипов. Главное преимущество технологии в сравнении с привычными для нас процедурами сдачи анализов – это оперативность.

Есть ряд заболеваний, на диагностирование которых даже у лучших врачей уходит несколько недель. Например, чтобы выявить возбудителя туберкулеза, понять, какие лекарства необходимо выписать пациенту, доктора могут потратить даже десять недель, а это огромный срок для больного организма. Все это время пациент лежит в больнице, принимает препараты, которые не дают стопроцентной гарантии того, что они помогут организму. Для одних больных эти препараты подходят, другим же они не приносят никакой пользы. В итоге человек может потратить масса денег на лечение и обслуживание в стационаре, при этом должного лечения он не получит. Лишь один пример говорит о том, насколько сейчас печальная ситуация в медицине.

Внедрение Биологических чипов

Биологические чипы – это возможность проведения анализа здоровья больного не более чем за 24 часа. Они станут не только прекрасной экономией времени и денег для пациента, но и помогут даже всей медицине в стране с экономить значительную часть бюджета. Внедрение данной технологии – это огромное вложение в медицинскую сферу и в экономию денежных средств страны. Есть даже официальные цифры, говорящие о том, что всего за год государство может разумно сэкономить 5 миллиардов рублей благодаря биочипам.

Экономия для пациента основана на том, что ему не придется тратиться на огромное количество анализов, чтобы проверить весь свой организм на наличие заболевание. Один из кандидатов химических наук заявил, что всего лишь благодаря одному анализу с использованием новой технологии пациент сможет проверить свой организм на наличие восьми маркеров онкологических заболеваний. Причем по сегодняшним данным чип способен с 90% вероятностью точно выявлять болезнь и диагностировать ее верным образом. Сейчас человеку нужно отдать около семи тысяч рублей, чтобы сдать анализы на все распространенные онкозаболевания. С чипом пациент потратил бы не более тысячи рублей. Взять тот же туберкулез – после внедрения технологии пациенту понадобится около пятисот рублей, чтобы пройти обследование на наличие данной заболевании. Отметим, что за рубежом стоимость одного чипа составляет около двух долларов.

Микробиологи провели свои исследования и заявили, что с помощью технологии действительно есть все шансы диагностировать огромное количество заболеваний за короткий период времени. Например, чип позволяет выявить многие виды лейкоза, ВИЧ, гепатит B и C, несколько видов гриппов, герпес и многие другие болезни. Анализы будут готовы уже через пару часов после проведения обследования. Если есть шансы возникновения эпидемии, использование биочипов сыграет важную роль в медицине за счет своей оперативности.

Менее чем за сутки у специалистов будет возможность оценить риски опасности, которые относятся к тем или иным вирусам. Они смогут определить также уровень пандемичности. И это уже доказано. Кандидат биологических наук Грядунов заявил, что многие в момент появления гриппа H1N1 ужасно его боялись, хотя, на самом деле, огромной опасности для человека он не представлял, поскольку его белковая оболочка была крайне уязвима. В случае с птичьим гриппом нет шансов возникновения эпидемии ввиду того, что от одного человеческого заболевания к другому он передаваться не может.

Светлая метка

Конструкция чипов не так сложна. Есть миниатюрная пластинка, на которую прикрепляют матрицу. В матрицу входят множество ячеек. Их размер не превышает ста микрон. Всего лишь на одном квадратном миллиметре матрицы может поместить несколько сотен ячеек. Их можно сравнить с маленькими пробирками.

Александр Чудинов, который лично участвует в разработке биологических микрочипов, заявил, что основа технологии – это особо свойство молекул ДНК. Это двойная спираль, которая строится с помощью 2-ух полимерных цепей. Принцип построения – комплементарный.

Ученым необходимо самостоятельно создавать одну цепь отрезка ДНК, можно заняться созданием и олигонуклеотида. Самое главное, учитывать правильную последовательность построения цепи. Та последовательность, которая образуется после мутации, выявляющей болезнь, является правильной. Данные отрезки ученым необходимо привязать к ячейке чипа. Далее матрицу необходимо поместить в специальный корпус, где она будет герметично защищена. Остается сделать работу лаборанту – провести грамотный анализ. В качестве образца может выступать ДНК вирус, взятый из крови или слюны. Возможно ли изучение ДНК конкретно больного? Конечно, если будет, например, генетическая предрасположенность к той или иной болезни, ее удастся выявить за несколько часов. Есть даже шансы диагностировать индивидуальную переносимость определенных болезней.

Работа лаборанта заключается в следующем. Полученный образ нужно отправить в пробирку, после в нее добавить еще несколько ферментов и нуклеотиды (ряд нуклеотидов помечают флуоресцентным веществом).

В итоге начинается реакция синтеза. Это приводит к значительному увеличению количества ДНК отрезков. И что самое главное, у каждого отрезка будет флуоресцентный маркер. Теперь «готовую» пробу заливают в чип. В случае наличия последовательностей, в которых есть мутации, образуется их связь с отрезками. У этих отрезков до этого момента были изменены последовательности. В результате последовательности окрашивают нужную ячейку маркером.

На этом работа не заканчивается, ведь нужно еще позаботиться об обработке чипа определенным растворам. После этой процедуры его отправляют в специальное считывающее устройство. Его называют флуоресцентным анализатором, работающим с помощью компьютера. Теперь к работе приступает программа. Она проводит анализ картины светящихся ячеек, благодаря чему появляется информация конкретно о тех отрезках ДНК, которые получили изменения. В итоге у специалиста есть данные касаемо того, какие гены изменились, какие заболевания у пациента есть, что за бактерии и вирус поражают его организм.

Формат ячеек – трехмерный. И это на руку ученым, поскольку есть возможность использования огромного количества отрезков ДНК. Чем больше отрезков, тем выше процент точности результатов анализа. Сегодня есть даже специальные 3D-ячейки, в которые можно отправить молекулы и быть уверенными, что они потеряют свои биологические свойства. Для этого был создан гидрогель, который способен сохранять свойства. Гидрогель можно сравнить с средой, в которой обитают молекулы в биологических структурах, различий очень мало. Благодаря таким разработкам биочипы могут работать в течение 12 месяцев . В плане транспортировки их не возникает никаких вопросов – условия особо критичные технологии не требуются.

Как сейчас обстоят дела с технологией?

Пока биочипов в клиниках не встретишь, поскольку работа только на этапе клинических испытаний. Диагнозам чипов слепо не доверяют – их сверяют с привычными для нас методами выявления болезней. Тем не менее, все микробиологи уверены, что за биочипами стоит будущее, нужно лишь уделить достаточно внимания этой технологии.

Отметим, что в 2016 году многие исследования были направлены в сторону борьбы с болезней Альцгеймера. Также активно изучалась шизофрения, алкоголизм. Было уделено внимание и разработке диагностического теста-системы, основа которой заключается именно в использовании биочипов , способных выявить предрасположенность к вышеперечисленным болезням.

Нельзя сказать, что чипы – это разработка, которую кроме как в здравоохранении нигде больше нельзя будет применять. Даже правоохранительные органы проявили интерес к биочипам. Специально для этой области были разработаны специальные чипы, справляющиеся с идентификацией двадцати трех маркеров. Это большое количество, поскольку его достаточно для определения десятков тысяч различных вариантов генома человека. Грубо говоря, чип будет давать информацию высокой точности касаемо того, способен ли человек совершить то или иное преступление. Для теста понадобятся исключительно биологические образцы, в роли которых может выступать слюна, волос и т.д.

Естественно, пока следственные действия не проводятся с использованием чипа, поскольку пока не доказано, насколько точную и правдивую информацию он дает. Но ученые заявляют, что использование данной технологии крайне благоприятно скажется на развитии области правоохранительных органов. Что можно сказать в итоге? До эпохи, которая раньше казалось фантастической в молекулярной биологии, осталось совсем недолго.

Биочип для ранней диагностики рака

Ученые Национальной лаборатории Аргонн Исследовательского центра ядерной энергетики (г. Чикаго, штат Иллинойс) разработали биочип, позволяющий диагностировать определенные типы рака до появления его симптомов.

Компания Eprogen лицензировала эту технологию и использует для поиска новых биомаркеров рака. Опухоли, даже на самых ранних, бессимптомных стадиях, вырабатывают белки, попадающие в кровоток и запускающие иммунные реакции, в частности, синтез антител. Специалисты компании утверждают, что сравнение профилей аутоантител здоровых людей и онкологических пациентов является перспективным методом поиска ранних индикаторов заболеваний.

Используемый ими процесс, получивший название двумерное фракционирование белков, позволяет сортировать тысячи различных белков злокачественных клеток по различиям их электрического заряда и гидрофобности. С помощью этого метода исследователи получают 960 белковых фракций, которые помещают в биочип, содержащий 96-луночные пластинки. После этого биочип обрабатывают заранее известными аутоантителами, синтезируемыми иммунной системой онкологических пациентов.

Использование аутоантител больного для диагностики позволит врачам подбирать лечение согласно его индивидуальному профилю аутоантител. Уникальность нового метода заключается в том, что ученые используют реальные данные о заболевании человека для получения новой, более подробной диагностической информации, которую специалисты могут использовать для изучения и лечения рака.

По словам разработавшего технологию специалиста Национальной лаборатории Аргонн Дэниеля Шабакера (Daniel Schabacker), биочипы уже продемонстрировали большой потенциал в диагностической медицине. Кроме Eprogen, технологию лицензировали еще три компании. Одна из них, Akonni Biosystems, уже разработала на ее основе несколько десятков тестов, выпускаемых под торговой маркой TruArray. Еще одна компания, Safeguard Biosystems, лицензировала биочипы для создания ветеринарных диагностических наборов.

Например, при диагностике заболеваний верхних дыхательных путей содержащиеся в мазке из полости рта пациента антитела или ДНК связываются с нанесенными на биочип молекулами. После обработки лунки биочипа, в которых произошло такое связывание, начинают светиться. Специальная программа расшифровывает сканированное с помощью компьютера изображение, рассчитывает статистическую вероятность присутствия того или иного инфекционного агента и предоставляет информацию врачу.

Разработка диагностических средств, подобных TruArray, способна совершить революцию в диагностике, т.к. она позволяет одновременно проводить диагностику большого количества заболеваний. Одним из уникальных свойств метода является возможность одновременного тестирования на инфекции бактериальной и вирусной природы.

Проведение анализа с помощью биочипа занимает около 30 минут и обеспечивает конфиденциальность и высокую точность диагностики, т.к. врач, не выходя из кабинета, может практически на глазах пациента определить характер заболевания и стадию его развития.

У пациентов с сахарным диабетом мелкие плотные частицы Х-ЛПНП содержат гликозилированный Апо В

Charlton-Menys (University of Manchester, Великобритания) оценили степень гликозилирования различных субфракций липидов у 44 добровольцев с СД. Оказалось, что средний уровень гликозилированного Апо В составил 3,0 мг/дл, причем 84,6% гликозилированного Апо В были в составе Х-ЛПНП, а 67,8% - в составе наиболее атерогенной субфракции, а именно мелких плотных частиц Х-ЛПНП.

Уровень мелких плотных частиц Х-ЛПНП в наибольшей степени коррелирует с толщиной интима-медиа сонных артерий

Tetsuo Shoji (Osaka City University Graduate School of Medicine, Япония) с соавторами определи уровни липидов у 326 пациентов, обследованных по поводу индекса массы тела сонных артерий. Исследователи показали выраженную корреляцию уровня мелкого плотного Х-ЛПНП с толщиной интимы-медиа сонных артерий (коэффициент корреляции 0,441). Корреляция других липидов с толщиной интимы-медии оказалась следующей: аполипопротеин В (0,279), Х-ЛПНП 0,249), и триглицериды (0,175). У пациентов с высоким уровнем С-реактивного белка уровни мелких плотных Х-ЛПНП оказались ниже, чем у пациентов с низкими уровнями С-реактивного белка.

Atherosclerosis 2008; Advance online publication.